2.1. 물벼룩

물벼룩은 갑각류로 담수에서 서식하며, 종에 따라 수명과 크기가 다양하다[6]. 물벼룩 중 Daphnia magna는 수질오염공정시험기준[7](ES 04704.1b)에 따라 생태독성 분석에 이용되며, 암컷 성체의 외형은 Fig. 3과 같다[2]. Daphnia magna는 상대적으로 크기가 큰 동물성 플랑크톤이고[8], 크기는 보통 0.5 mm에서 6 mm이며, 평균수명은 25^oC에서 40일, 20^oC에서 56일이다[6]. 물벼룩의 생식은 단위생식과 수정생식을 통해 이뤄지며, 환경상태에 따라 좌우된다. ES 04704.1b에서 제시하는 배양환경에서, 성체 Daphnia magna 암컷은 암컷만을 생산하는데, 이를 단위생식이라고 한다. 20^oC에서 하루 보통 6~10개의 알을 가지며 50일 동안 57개 정도의 알을 낳는다[2].

Fig. 3.

Appearance of female Daphnia magna

2.2. 배양액

배양액은 Daphnia magna가 생존하기 위한 배지로 ES 04704.1b에 따라 제조한다. 제조된 배양액은 용존산소 3 mg/L이상, pH 7.6~8.0, 경도 160~180 mg/L as CaCO₃, 알칼리도 110~120 mg/L as CaCO₃ 이어야 한다. 상기된 항목들을 Table 1에 따라 주 1회 이상 측정하여 적합성을 확인한다. 월, 수, 금요일에 스포이드를 이용하여 Daphnia magna들을 새로 제조된 배양액으로 옮겨주어 쾌적한 환경에서 배양되도록 한다.

Table 1.

Culture medium analysis: target ingredients and methods

2.3. 배양조건

ES 04704.1b에 따라 물벼룩의 배양조건은 다음과 같다. 온도는 20±2^oC, 조도는 500~1000 Lux으로, 16시간은 빛을 공급해주고, 8시간은 어두운 상태가 되도록 유지해야 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물벼룩 배양기 안에서 배양해야 한다.

2.4. 먹이

Daphnia magna의 먹이로는 녹조류인 Chlorella vulgaris와 YCT를 사용한다. Chlorella vulgaris의 형태는 Fig. 4와 같으며[2], YCT는 Yeast, Cerophyll, Trout chow가 혼합된 것이다. Chlorella vulgaris와 YCT는 (주)에버그린탑에서 제작하는 것을 사용하였다.

Fig. 4.

Appearance of Chlorella vulgaris.

2.5. 계대배양

생후 24시간 미만의 Daphnia magna 네오네이트 50마리를 배양액이 담긴 2 L 비커에 스포이드로 이동시킨 후 이를 2일차 배양이라고 명명한다. 계대배양은 배양조건 하에서 수행되며, 먹이는 매일 공급하고, 배양일차에 따라 점진적으로 공급량을 증가시킨다(Table 2). 먹이를 투여 할 수 없는 휴일에는, 휴일 전날에 다음날 투여할 양을 추가해서 공급한다. 배양일차가 대략 9일차에 도달하였을 때, 성장한 Daphnia magna 10마리를 배양액이 담긴 1 L 비커에 스포이드로 이동시킨다. Daphnia magna의 수와 성장대비 과도한 먹이가 공급되면 chlorella가 Daphnia magna의 몸체에 부착되어 유영을 저해할 수 있기 때문에[2], Table 2와 Table 3에 따라 먹이를 공급하였다. 단, 비커바닥이 녹색을 띄면, chlorella와 YCT가 과도하게 축적되었다고 가정하여, 먹이투여량을 감소시켰다. 배양 12일차 이상의 성체 Daphnia magna로부터 출산된 네오네이트 5 0 마리를 배양액 2 L에 스포이드로 옮겨 배양한다. 네오네이트가 성체가 될 때까지 배양하며, 계대 배양을 반복하였다.

Table 2.

Feeding amount per 50 neonates according to the culture day

Table 3.

Feeding amount for 10 adult Daphnia magna per one liter after separation

2.6. 급성독성시험

급성독성시험이란 검체를 시험동물에 일회 투여하였을 때 단기간 내에 나타나는 독성을 질적·양적으로 검색하는 시험을 말한다[9]. ES04704.1b에서의 물벼룩을 이용한 급성독성시험의 시험기간은 24시간으로 한다. 시험절차는 다음과 같다. 시험 하루 전, 생후 약 2주 이상의 성체 물벼룩이 배양되고 있는 비커에서 암컷 네오네이트를 스포이드로 전부 제거한다. 시험당일 성체 물벼룩이 배양되고 있는 비커에 chlorella와 YCT를 각각 0.5 mL씩 공급한다. 시험 전에, 생후 24시간 미만의 암컷 네오네이트 120마리를 배양액이 든 1 L 비커에 스포이드로 옮긴다. 시험 전 먹이에 의한 영향이 없도록 chlorella와 YCT를 각각 1 mL씩 공급한다. 시료를 4개의 5 0 mL 비커에 각각 5 0 mL 분취한다. 비커마다 생후 24시간 미만의 네오네이트 5마리씩 스포이드로 옮긴다. 결과적으로 시료 1개당 20마리의 네오네이트가 노출된다. 네오네이트가 든 비커들을 배양조건(Table 4)에서, 먹이공급없이 방치한다. 정확히 24시간 후, 비커를 가볍게 건드리고 15초 동안 영향받은 네오네이트의 수를 센다. 영향받은 개체란 치사하거나 또는 유영에 저해를 받은 개체를 의미하며, ES 04704.1b에서 유영저해란 안테나 또는 부속지가 움직인다 하더라도, 유영을 하지 못하는 상태로 정의한다. 다만, 급성독성시험의 결과는 시험생물의 건강, 시험자의 숙련도에 따라 달라질 수 있다[2].

Table 4.

Acute toxicity test condition

2.7. EC₅₀

EC₅₀은 Effective Concentration of 50%로, 시료를 시험체에 노출 시 24시간내에 반수가 사망하거나 또는 유영저해가 되는 농도[2]이다. ES 04704.1b에 따라 EC₅₀은 통계적인 방법으로 산출되는데, 먼저 시험생물에 대한 Log농도–반응(%) 곡선이 작성되어야 한다. Log농도–반응(%) 곡선은 시그모이드 곡선이라고도 불리며, 예는 Fig. 5와 같다[10]. 시그모이드 곡선으로부터 시험생물들의 반수가 영향받는 농도가 결정된다[11]. EC₅₀ 산출을 위한 시험 절차는 다음과 같다. 시험 하루 전, 생후 12일 이상의 성체 물벼룩이 배양되고 있는 비커에서 네오네이트를 스포이드로 전부 제거한다. 시험당일 오전에 성체 물벼룩이 배양되고 있는 비커에 Chlorella와 YCT를 각각 0.5 mL씩 공급한다. 시험 전에, 생후 24시간 미만의 네오네이트 120 마리를 배양액이 든 1 L 비커에 스포이드로 옮긴다. 시험 전 먹이에 의한 영향이 없도록 Chlorella와 YCT를 각각 1 mL씩 공급한다. 시료원액을 배양액으로 희석하여 각각 6.25 %, 12.5 %, 25 %, 5 0% 희석시료를 제조한다. 배양액, 희석시료들 및 시료원액을 4개의 50 mL 용량의 비커에 각각 50 mL 씩 분취한다. Fig. 6과 같이[10] 비커마다 생후 24시간 미만의 네오네이트 5마리씩 스포이드로 옮긴다. 실시예는 Fig. 7과 같으며, 결과적으로 시료 1개당 20마리의 네오네이트가 노출된다. 네오네이트가 든 비커들을 배양조건(Table 4) 에서, 먹이공급없이 방치한다. 정확히 24시간 후, 배양액, 6.25% 희석시료가 든 비커에서 시료원액이 든 비커 순으로 가볍게 건드리고 15초 동안 영향받은 네오네이트의 수를 센다. EC₅₀값은 Probit법 또는 TSK (Trimmed Spearman Karber)법을 사용하여 산출한다(ES 04704.1b). Probit method는 0%, 100% 치사 및 유영저해 데이터와 1~99% 치사 및 유영저해 데이터가 2개 이상 존재할 경우 적용한다. TSK는 0% 과 100% 치사 및 유영저해 데이터를 제외한 1~99% 치사 및 유영 저해 데이터가 1개 이하일 때 사용한다[2]. 치사 및 유영저해율(%) = 농도당 영향받은 개체수/농도당 노출된 총 개체수 x 100이다. 예를들어 5 0% 희석시료에서 4마리의 네오네이트가 영향을 받은 경우, 50% 희석시료에서 치사 및 유영저해율(%)은 4/20 x 100으로 20%이다. 농도에 따른 영향개체수를 Probit 프로그램 또는 TSK 프로그램에 입력시, EC₅₀값이 산출된다.

Fig. 5.

Example of a function graph showing the log value of the concentration-response (%).

Fig. 6.

Schematic diagram of the dilution ratio and number of specimens.

Fig. 7.

Example of EC₅₀ confirmation test.

2.8. TU

TU는 Toxic Unit으로, 생태독성의 지표이다. TU는 100/EC₅₀으로 계산된다. 높은 값은 강한 독성을 의미하고, 낮은 값은 낮은 독성을 의미한다. 대한민국 방류수 생태 독성 기준은 Table 5와 같다[12].

Table 5.

Korea’s ecotoxicity emission standard

2.9. 표준독성 시험

ES 04704.1b에 따라 Daphnia magna의 건강상태와 독성민감도를 확인하기 위해 1달에 1회 이상 중크롬산칼륨(potassium dichromate)을 이용하여 표준독성 시험을 수행해야한다. 표준독성 시험의 시험절차는 EC₅₀ 산출을 위한 시험절차와 같으나, 시료원액을 potassium dichromate으로 제조한다. potassium dichromate 1 g을 정확히 측량한 후 1 L 부피플라스크에 넣고 정제수를 투입하여 표선을 맞춰 potassium dichromate 1000 mg/L의 표준원액을 제조한다. 시험액의 농도는 2~5 mg/L가 되도록 제조해야 하므로[2], potassium dichromate 1000 mg/L 표준원액 3 mL를 분취 후 1 L 부피플라스크에 넣고 배양액으로 표선을 맞춰 3 mg/L의 potassium dichromate를 제조하여 이것을 시험원액이라고 칭한다. 이 시험원액을 단계별로 희석 및 물벼룩을 투입하여 EC₅₀을 산출한다. 국제적 시험법 중 ‘specifies a method for the determination of the acute toxicity to Daphnia magna Straus (ISO 6341: 2012) [13]’에서 potassium dichromate에 대한 EC₅₀값의 적절한 농도범위는 0.6~2.1 mg/L라고 언급하고 있다. 그러나 수질오염공정시험기준(ES 04704.1b) 상 potassium dichromate에 대한 EC₅₀값의 적절한 농도범위는 0.9~2.1 mg/L으로, 수질오염공정시험기준의 허용 농도범위가 더 좁다. 수질오염공정시험기준을 준수하여 물벼룩을 배양하는 시험기관에서 산출된 EC₅₀값이 0.9~2.1 mg/L에 포함되면, 시험기관이 배양중인 물벼룩의 건강상태와 독성 민감도는 일정한 수준을 유지하고 있다고 할 수 있다. 만약 범위를 벗어났다면 재시험을 수행한다. 재시험 결과에서도 EC₅₀값이 범위를 벗어났다면, ES 04704.1b에 따라 시험을 중지하고 물벼룩을 전량 폐기 후 새로운 개체를 분양받아야 한다.

2.10. 물벼룩 네오네이트 분리장치

물벼룩의 네오네이트 분리장치는 주문제작품과 기성품을 결합하여 제작하였다(특허출원번호 10-2023-0083332). 구성요소들이 완전히 결합된 분리장치의 등각투상도는 Fig. 8과 같고, 정면도는 Fig. 9와 같으며, 총 3개의 층으로 구성된다. 1층과 3층에는 배수밸브가 설치되며, 1층의 깔때기는 1층 배수밸브 내부와 연결된다. 깔때기 위, 2층과 3층 사이에는 각각 1 mm 공극이 있는 실리콘시트가 설치된다. 또한 마지막으로 2층과 3층사이에 설치된 실리콘시트 위에, 계단식 원형트랩이 설치되어, 추후 3층에 존재하는 배양액이 제거시 흐름의 사구역이 생기지 않도록 하였다. 2층과 3층 사이에 실리콘시트를 설치하기 전, 배양액과 생후 12일차의 성체 Daphnia magna를 투입하였다. 성체 Daphnia magna의 몸체 크기는 1 mm 이상이므로 2층에서만 유영하게 된다. Daphnia magna의 네오 네이트는 몸체 크기범위가 0.5 ~1 mm 이므로[14], 실리콘시트를 통과할 수 있어서 모든 층에서 유영할 수 있다.

Fig. 8.

Isometric view of separation apparatus.

Fig. 9.

Front view of separation apparatus.

2.11. 물벼룩 연속분리 및 연속배양 방법

물벼룩 연속분리 및 연속배양을 위해 배양액과 생후 12일차의 성체 Daphnia magna가 담긴 분리장치를 물벼룩 배양기 안에 위치시키고, 분리장치에 주문제작품과 기성품을 결합시켰다(Fig. 10). 자동펌프들은 작동시간과 흡입량을 설정할 수 있는 제품을 사용하였고, 분리장치의 1층과 3층에 설치된 배수밸브에, 각각 자동펌프(배양액 제거용)와 연결된 흡입튜브를 결합시켰다. 그 후 분리장치의 덮개에, 자동펌프(배양액 공급용)와 연결된 배출튜브를 결합시켰다. 이 방법을 통해 분리장치로부터 기존의 배양액과 네오네이트는 흡입튜브를 통해 흡입되고, 배출튜브를 통해 제거되어 준비된 포집용기에 포집된다. 또한 새로운 배양액은 펌프에 의해 흡입되어, 배출튜브를 통해 분리장치에 공급된다. 새로운 배양액이 공급되고 있는 사진은 Fig. 11과 같다. 기존의 발명과 다르게, 이 방법은 펌프의 병렬운전 및 1층 깔때기 부분에서 단면이 축소되며 유속이 증가하는 현상(벤츄리 플룸)을 이용하여, 배양공간 내 기존 배양액과 네오네이트를 빠르게 제거할 수 있다. 본 연구에서는 매일 오후 2시 30분에 분리장치 내 기존 배양액 및 네오네이트가 펌프에 의해 제거되어 포집되도록 설정하였다. 배출량의 경우, 배출 후 남은 배양액의 수위가 1층과 2층 사이에 설치된 실리콘시트 보다 약 1.5 cm 높게 유지되도록 설정하여, 기존 배양액이 제거되어도 성체 물벼룩이 유영 가능하게 하였다. 그리고 매일 오후 3시에 새로 제조하여 담아둔 배양액이 펌프로 자동 공급되어 배양장치를 채우도록 설정하였다.

Fig. 10.

Combined view of separation apparatus and continuous culture method.

Fig. 11.

Supply of new culture medium through the discharge tube.

2.12. 먹이 자동공급 방법

먹이 자동공급을 위해 물벼룩 연속분리 및 연속배양 방법에 주문제작품과 기성품을 혼합하였다(Fig. 12). 시판된 클로렐라와 YCT를 각각 배양액으로 희석 후 바닥이 원추형인 용기에 담고, 5^oC이하의 온도를 유지할 수 있는 냉장장치 안에 위치시켰다. 그 후 작동시간을 조절할 수 있는 타이머에 폭기장치를 결합하고, 폭치장치에 연결된 튜브의 말단부를 희석된 먹이가 담긴 용기의 바닥에 설치하였다. 자동펌프(먹이 공급용)는 작동시간과 흡입량을 설정할 수 있는 제품을 사용하였으며, 흡입튜브(불투명 흑색)의 말단부를 희석된 먹이가 담긴 용기의 바닥에 설치하였고, 배출튜브(불투명 흑색)는 분리장치의 덮개에 결합하였다. 마지막으로 냉장장치의 문을 폐쇄하였다. 기존의 발명과 다르게, 이 방법은 폭기를 통하여 침전성이 강한 클로렐라와 YCT를 균질화 할 수 있다. 또한 먹이 공급용 튜브가 불투명 흑색이고, 먹이가 담긴 용기는 냉암소의 냉장장치에 보관하므로 온도와 빛에 의한 클로렐라의 부패 또는 증식을 방지할 수 있다. 본 연구에서는 매일 오후 2시에 타이머와 연결된 폭기장치가 작동하도록 하여, 희석된 클로렐라와 YCT를 40분 동안 폭기 및 균질화시켰다(Fig. 13). 그리고 매일 오후 2시 40분에 자동 펌프(먹이 공급용)가 작동하도록 하여, 분리장치에 희석된 클로렐라와 YCT가 공급되도록 하였다.

Fig. 12.

Combined view of separation apparatus and automatic feeding method.

Fig. 13.

Homogenization of chlorella and YCT using aeration.

2.13. 생존 확인시험

물벼룩의 네오네이트 연속식 분리장치를 기반으로 한 물벼룩 연속배양방법, 먹이 자동공급방법을 통해 성체 Daphnia magna의 40일간 생존가능성을 확인하였다. 1개의 분리장치에 생후 12일차의 성체 Daphnia magna 10마리를 투입하였다. 이때 투입된 Daphnia magna는 연구를 시작할 당시 배양 중인 55대(55_th Generation)의 Daphnia magna였다. 그 후 Fig. 14와 같이 분리장치 3개를 병렬 연결하여, 펌프에 연결된 흡입튜브와 결합시켰다. 연속배양 및 먹이 자동공급방법을 이용해 배양하였고. 매일 생존한 개체수를 확인하였다.

Fig. 14.

Parallel connection of three separation apparatuses.

3.1. 연속배양 및 먹이 자동공급방법을 통한 생존확인 시험

휴일을 제외하고, 매일 각 분리장치 내 성체 Daphnia magna의 생존수를 확인하였다. 생후 40일간 관찰한 결과는 Table 6과 같았다. 3개의 분리장치에서 각각 배양된 10마리의 성체 물벼룩들은 사망하지 않고 생후 40일까지 모든 개체가 생존하였다.

Table 6.

Survival Daphnia magna results in continuous culture apparatus

3.2. 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험

실험 재료 및 방법의 표준독성 시험에 따라 55대 성체 물벼룩을 지수식으로 배양하고, 성체로부터 출산된 움직임이 활발한 생후 24시간 미만의 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 수행하였다. 재현성 확인을 위해 표준독성 시험을 4회 반복 수행하였으며 결과는 Table 7과 같았다. 기존 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 4회 반복하여 산출된 EC₅₀의 최솟값은 0.989 mg/L, 최댓값은 1.098 mg/L, 평균값은 1.043 mg/L였다.

Table 7.

Standard reference toxicity test results of neonate separated from static non-renewal culture (2023.04.20 ~ 2023.05.03)

3.3. 분리장치로부터 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험

지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험이 수행된 날, Fig. 12와 같이 분리장치 3층 배수 밸브와 연결된 펌프에 의해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 수행하였다. 실험 재료 및 방법의 표준독성 시험에 따라 55대 성체 물벼룩이 담긴 분리장치로부터 분리된 움직임이 활발한 생후 24시간 미만의 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 수행하였다. 재현성 확인을 위해 표준독성 시험을 4회 반복 수행하였으며 결과는 Table 8과 같았다. 분리장치에 연결된 펌프로 분리한 네오네이트에 대해 표준독성 시험을 4회 반복하여 산출된 EC₅₀의 최솟값은 0.68 mg/L, 최댓값은 0.932 mg/L, 평균값은 0.840 mg/L였다.

Table 8.

Standard reference toxicity test results of neonate separated continuous culture (2023.04.20 ~ 2023.05.03)

기존 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험 평균값에 비하여, 분리장치에 연결된 펌프로 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험값의 평균값이 0.203 mg/L만큼 낮았다. 또한 분리장치에 연결된 펌프로 분리된 네오네이트에 대한 4회의 표준독성 시험 중 2회 시험의 EC₅₀값들이 수질오염공정시험 기준 상 만족범위에 포함되지 않았다. 펌프를 이용하여 Daphnia magna의 네오네이트를 포집시, 물벼룩의 건강상태에 이상이 생겨 표준독성 시험결과에 영향을 미칠 수 있다고 생각하였다. 펌프를 이용하여 채수시, 물리적 충격이 발생하여 동물성플랑크톤의 사망율에 영향을 미칠 수 있다는 것[15]을 확인하였다. 물리적 충격을 방지하기 위해 Fig. 15와 같이 설치한 후 시험 전 3층 배수밸브를 수동으로 열어, 중력에 의한 자연유하로 55대 성체의 네오네이트를 포집하였다. 이후 수질오염공정시험기준에 따라 표준독성 시험을 수행하였다. 재현성 확인을 위해 표준독성 시험을 4회 반복 수행하였으며 결과는 Table 9와 같았다. 분리장치로부터 자연유하로 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 4회 반복하여 산출된 EC₅₀의 최솟값은 0.956 mg/L, 최댓값은 1.026 mg/L, 평균값은 0.992 mg/L였다. 또한 중력에 의한 자연유하로 네오네이트를 포집하여 표준독성 시험이 수행된 날, 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 수행하였다. 실험 재료 및 방법의 표준독성 시험에 따라 55대 성체 물벼룩이 담긴 분리장치로부터 분리된 움직임이 활발한 생후 24시간 미만의 네오네이트에 대한 표준독성시험을 수행하였다. 재현성 확인을 위해 표준독성 시험을 4회 반복 수행하였으며 결과는 Table 10과 같았다. 기존 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험을 4회 반복하여 산출된 EC₅₀의 최솟값은 0.962 mg/L, 최댓값은 1.097 mg/L, 평균값은 1.020 mg/L였다. 기존 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험 평균값에 비하여, 분리장치로부터 자연유하로 분리된 네오네이트에 대한 표준독성 시험값의 평균값이 0.027 mg/L만큼 낮았다. 또한 기존 지수식 배양을 통해 분리된 네오네이트에 대한 4회의 표준독성 시험 EC₅₀값들과 분리장치로부터 자연유하로 분리된 네오네이트에 대한 4회의 표준독성 시험 EC₅₀값들은 모두 수질오염공정시험 기준 상 만족범위에 포함되었다.

Fig. 15.

Neonate separation method in natural flow from continuous culture.

Table 9.

Standard reference toxicity test results of neonate separated in natural flow from continuous culture (2023.05.04 ~ 2023.05.11)

Table 10.

Standard reference toxicity test results of neonate separated from static non-renewal culture (2023.05.04 ~ 2023.05.11)