1. 서 론
인간의 산업 활동이 고도화되고 생활 편의를 위한 다양한 화학물질이 합성 및 사용됨에 따라 각종 오염물질이 수계로 유입되고 있다. 수질오염물질 종류로는 생활하수에서 배출되는 의약물질 및 개인위생용 화학물질, 농 · 축산폐수에서 유출되고 있는 항생제 등의 동물용 의약물질과 농약류 물질 등이 있으며 이들 화학물질은 국내 수계로 배출되어 존재하고 있다. 의약물질은 질병의 치료를 목적으로 개발되어 인체 및 동물, 농 · 수산물 등을 위하여 광범위하게 사용되는 물질로 산업의 발달과 함께 건강에 대한 관심이 높아지고 사회가 고령화되어 가면서 소비량도 점점 늘어나고 있다[1]. 의약품통계연보에 따르면 2022년 기준 의약물질의 국내 시장규모는 약 29.9조 원으로 매년 증가하고 있으며[2], 사용량이 증가함에 따라 수계 배출량 또한 늘어나는 실정이다.
물환경에 잔류하는 의약물질은 ng/L에서 μg/L 수준의 농도로 지속적으로 존재하면서 만성적인 독성 효과를 일으킬 수 있다[3]. 일부 의약물질의 경우 인간에게 잠재적 발암성이 있는 것으로 연구되고 있는데, 당뇨병 치료제인 Pioglitazone은 국제암연구기관(International Agency for Research on Cancer, IARC)에 의해 Group 2A (Probably carcinogenic)로 분류되었다. 의약물질에 대해서는 지표수에 대한 수질기준이 아직 설정되지 않았으나 신종오염물질의 관리 및 규제를 위하여 세계적으로 모니터링되고 있으며 미국 식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)은 의약물질에 대한 환경 위해성 평가를 위한 독성 농도 기준을 1 μg/L로 제시한 바 있다[4].
의약물질 외에도 물환경에서 농약류가 지속적으로 검출되고 있으며, 농약류는 농작물을 해치는 동 · 식물을 방제하거나 농작물의 생육 증진을 위해 사용하는 약제로 현대 농업에 있어 필수 불가결한 요소로 인식되고 있으며 사용 목적에 따라 미생물을 방제하기 위한 살균제, 해충을 방제하기 위한 살충제, 잡초를 방제하기 위한 제초제 등으로 나뉜다[5]. 산업화 및 도시화에 따른 인구 증가와 농업기술의 발달, 소비자 식습관 변화로 인해 각종 과채류에 대한 수요 및 공급이 증가함에 따라 농약류의 사용량도 점진적으로 증가하였으며, 2021년 보고된 국내 농약류 총 생산량은 18,787톤에 달하는 것으로 조사된다[6].
살포된 농약은 초기에는 주로 토양에 머무르지만 강우 등으로 인해 수계에 유출된다[5]. 수계 중 농약류의 거동은 반감기, 용해도, 흡착력과 같은 특성에 의해 결정되는 데 미생물 또는 광화학적 분해율이 낮은 농약류는 반감기가 길어 잘 분해되지 않기 때문에 잠재적으로 물환경을 오염시킬 가능성이 있다[7]. 또한 먹는 물로의 이용과 먹이사슬 단계를 통해 인간에게 영향을 주어 만성독성을 나타낼 수 있다[5]. 이러한 특성으로 인해 국외에서는 농약류에 대한 제도적인 관리가 진행되고 있는데, 유럽연합에서는 먹는 물에서 존재하는 살충제의 총 농도를 0.5 μg/L (개별 0.1 μg/L)로 제한한 바 있으며[8], 미국 환경보호국(Environmental Protection Agency, EPA)은 일부 농약류에 대한 최대 오염 농도 (Maximum contaminant level)를 atrazine 3 μg/L, simazine 20 μg/L 등으로 설정하고 있다[9].
수질 시료에서 의약물질이나 농약류의 추출법으로 가장 많이 적용되는 전처리법은 고체상추출법(Solid phase extraction, SPE)이며, 흡착제로 HLB 카트리지가 주로 사용되고 있다[10-14]. US EPA에서는 수질 및 토양, 퇴적물, 생물시료에서 70종의 의약물질 및 개인위생용품(Pharmaceuticals and personnel products, PPCPs)을 검출하는 EPA method 1694와[15], 식수에서 10종의 의약물질 및 개인위생용품을 검출하는 EPA method 542를 정립한 바 있으며[16], 두 분석법 모두 HLB 흡착제를 적용하였다. HLB 흡착제 외에도 Strata-X [17-21], Cleanert PEP [22-24] 등을 사용한 수질에서의 의약물질을 분석 결과가 보고되고 있다. 농약류의 경우 수질 시료에서의 국내외 공정시험법은 존재하지 않지만 연구측면에서 다양한 분석법이 개발되어져 사용되고 있는데, HLB 흡착제[10, 25-28]를 사용한 연구 외에도 카바메이트계 살충제 6종의 흡착제로서 제올라이트(Zeolite) NaY가 사용되었고[29], Bond Elut Florisil 카트리지를 이용해 124종의 농약류를 분석한 바 있다[30].
이처럼 물환경에서 검출되는 다양한 의약물질과 농약류를 모니터링 하기 위해 다양한 분석법이 개발 및 사용되고 있으나, 서로 다른 흡착제 및 용매 조건을 사용하고 있어 같은 조건으로 동시에 다종의 물질을 분석할 수 있는 방법이 요구되고 있다. 따라서 최근에는 의약물질과 농약류 등 다양한 종류의 미량오염물질을 동시에 추출할 수 있는 분석법을 개발하기 위한 연구가 시도되고 있으며 대표적으로 양이온 및 음이온, 다양한 범위의 물-옥탄올 분배계수(Kow)를 가지는 중성 유기오염물질을 동시에 추출 가능한 다층 카트리지를 활용한 전처리법이 제안된 바 있다[31-33].
따라서 본 연구에서는 국내 물환경에서 주요하게 검출되는 43종의 의약물질 및 농약류를 대상으로 다층 카트리지를 활용한 고상추출법을 사용하여 수질시료에서의 동시분석 가능성을 평가하고 실제 하천수에 적용하여 오염 정도를 평가하고자 하였다.
2. 재료 및 방법
2.2. 전처리방법
수질 시료에서의 43종의 미규제 미량오염물질 동시추출을 위해 다층 카트리지를 사용한 선행연구 분석법[33,42,43]을 참고하여 적용하였다(Fig. 1). 물시료 500 mL를 준비하여 유리 섬유 여과지(GF/F, 0.47 μm)로 여과를 거친 후 정량용 내부표준물질(50 ng) 및 0.5 M 포름산(Formic acid) 40 μL를 첨가하였다. 이후 Isolute ENV+(150 mg, Biotage, Sweden), Strata X-CW(100 mg, Phenomenex, U.S.), Strata X-AW(100 mg, Phenomenex, U.S.), Oasis HLB(200 mg, Waters, U.S) 흡착제로 제조한 다층 카트리지를 이용해 SPE를 수행하였다. 카트리지의 추출 효율을 위해 5 mL 메탄올, 10 mL 초순수를 차례로 통과시켜 활성화시킨 후 시료를 약 5 mL/min의 유속으로 카트리지에 통과시켰다. 이후 카트리지의 수분을 제거하기 위해 약 30분간 건조시키고, 0.5% 암모니아를 녹인 메탄올/에틸아세테이트(1:1, v/v) 6 mL, 1.7% 포름산을 녹인 메탄올/에틸아세테이트 (1:1, v/v) 3 mL를 순차적으로 사용하여 분석대상물질을 용출하였다. 추출액은 질소 가스를 이용하여 농축시킨 후 메탄올을 이용해 최종 부피 1 mL로 만들어 0.45 μm PTFE 실린지 필터에 통과시켰다. 시료 바이알에 실린지 첨가용 내부표준물질(Sulfamethoxazole-13C6, 20 ng)을 첨가 후 0.5 mL은 Amoxicillin 분석을 위해 분취하고, 나머지 잔량은 초순수/메탄올 (9:1, v/v)로 0.5 mL로 재구성하여 LC-MS/MS로 분석하였다.
2.3. 기기분석
최적의 검출수준을 확보하고자 농약류(n=22)와 의약물질(n=21)의 기기분석은 일부 조건이 달리 적용되어 분석되었다. 농약류와 의약물질 분석 분석기기는 모두 Agilent사 1290 UHPLC와 결합된 6470B Tandem-mass spectrometer (Agilent technologies, Santa Clara, U.S.)를 사용하였으며, LC 컬럼은 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm pore size, Agilent technologies)을 사용하였다. 이동상 용매는 5 mM 포름산 암모늄 (Ammonium formate, Fujifilm Waco pure chemical, U.S.)과 0.1% 포름산 (Formic acid, Fujifilm Waco pure chemical)이 첨가된 물 (A)과 5 mM 포름산 암모늄과 0.1% 포름산이 첨가된 메탄올 (B)를 사용하였으며, 이동상의 구배(gradient)를 포함한 자세한 기기분석 조건을 Table 2에 나타냈다. 이온화원은 ESI (Electrospray ionization)을 사용하였으며, 각 대상물질에 대한 정량/정성이온(Quantification ion/qualification ion)을 선정하여 다중 반응 모니터링(Multiple reaction monitoring, MRM) 모드로 분석하였다.
2.4. 정도관리 방법
분석대상물질 43종에 대한 정량분석은 내부표준법을 사용하였으며 각 대상물질에 적용한 내부표준물질 목록(n=28)은 위 Table 1에 나타내었다. 분석법의 안정도를 평가하고자 정도관리 항목 중 회수율(Recovery), 정확도(Accuracy), 정밀도(Precision), 방법검출한계(Method detection limit, MDL), 정량한계(Limit of quantification, LOQ)를 검증하였다(Table 3). 정확도와 정밀도의 경우 하천수 시료 4개를 반복 실험하여 검증하였으며, 대상표준물질을 목표 정량한계(Limit of quantification, LOQ) 부근의 농도(10 ng/L)가 되도록 첨가한 후 얻어진 시료의 결과값 및 그 표준편차를 이용해 산출하였다. MDL과 LOQ의 경우, 초순수와 하천수 시료를 각각 7개씩 반복 분석하여 산출되었으며, MDL은 얻어진 표준편차에 자유도 3.143을 곱하여 산출하였으며, LOQ는 표준 편차에 10을 곱하여 산출하였다. 회수율의 경우, 전처리 전 주입한 정량용 내부표준물질과 기기분석 전 주입한 실린지 첨가용 내부표준물질(Sulfamethoxazole-13C6, 20 ng)의 농도에 따른 감응비(Response factor, RF)와 상대감응계수(Relative response factor, RRF)를 활용하여 검정곡선용 표준용액과 실제시료에서 계산하여 내부표준물질 회수율을 평가하였다. 모든 시료 분석에는 방법바탕시료(Procedural blank)를 수질 시료와 동일한 방법으로 전처리를 수행하여 실험과정 중 발생 가능한 오염도를 확인하였으며, 오염이 농도분석에 방해될 수준으로 높게 검출될 경우 재분석을 수행하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 동시분석 가능성 평가
3.1.1. 기기분석 조건 확립
상기 2.4절에 제안한 바와 같이 본 연구 대상물질인 43종 중 21종의 의약물질과 22종의 농약류 기기분석은 각 다른 조건으로 분석법이 확립되었으며, Table 1는 최종 확립된 MRM 분석조건을 나타내었다. 전반적으로 높은 선택성과 높은 감도를 보인 반면, 의약물질 중 amoxicillin의 경우 초순수가 포함된 용매 조건에서 현저히 낮은 기기분석 감도를 보여 메탄올이 결합된 부가물질을 전구 이온(Precursor ion)으로 설정하였다.
Fig. 2에 묘사된 바와 같이 amoxicillin (Fig. 2(a))은 4원자 고리 아마이드 구조의 베타-락탐 구조를 가지는데, 이 베타-락탐 구조는 큰 고리 무리(Ring strain)로 인한 불안정함 때문에 알코올의 존재 하에서 분해되기 쉽다[44]. 선행연구에서는 Amoxicillin (몰 질량: 365 g/mol)은 메탄올(몰 질량: 32 g/mol) 용매 내에서 베타-락탐 고리가 분해되어 메탄올 분자가 결합하면서 메탄올 부가물(몰 질량: 397 g/mol, Fig. 2(b))을 형성하는 경향이 있으며 모물질보다 높은 감도를 보인다고 제언한바 있다[45]. 실제 본 연구진이 수행한 기기분석 시 메탄올이 포함된 용매 조성에서 부가물을 형성하였으며, 100% 메탄올 하에서 기기분석 감도가 가장 높아 이를 전구 이온으로 설정하여 분석하였다(Fig. 3). 따라서 amoxicillin은 전처리 과정 중 최종 용매를 메탄올로 하여 다른 물질과 따로 분석하였다.
3.1.2. 동시 분석 가능성 평가 및 정도관리 결과
기존 선행연구에서 사용된 다층 카트리지 전처리법을[31-33] 본 연구 대상 미규제 유해물질 43종에 동시분석 적용 가능성을 평가하고자 실제 하천수에 표준물질을 주입하여 정확도 및 정밀도를 산출하였다. 43종 대상물질 표준물질(5 ng) 및 28종의 정량용 내부표준물질(50 ng)을 하천수 시료 250 mL에 각각 주입하여 4회 반복 실험하였으며 기기분석 전 실린지 첨가용 내부표준물질(20 ng)을 주입하였다(Table 3).
검정곡선은 표준용액 8단계(0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50, 100 ng/mL)로 작성하였으며, 검정곡선의 결정계수(R2)는 0.99 이상으로 나타났다. 더불어, 모든 대상물질에 대한 정확도는 70.2~121%로 나타났으며, 정밀도는 0.046~12%로 정량분석에 유효한 수준의 결과를 얻었다. 또한 정량용 내부표준물질 회수율은 18.0-127%로 나타났다. 본 연구에서 얻은 정도관리 결과는 환경매체 중 의약품 및 개인위생용품의 다성분 동시 분석법 기준을 제안하는 EPA method 1694의 기준안을 적용시, 전반적으로 만족하는 수준을 보여 본 연구진이 확인한 동시분석 가능성을 입증하였다 (유효성 기준; 정확도 70-130%, 정밀도 30%이내, 최대 허용 가능 회수율 범위 5-200%).
다층 카트리지를 이용한 전처리법의 검출한계를 산정하기 위해, 앞서 설명한 방법에 따라 초순수 시료와 하천수 시료 250 mL에 대상 표준물질 5 ng를 각각 첨가한 시료를 7개씩 반복 분석하여 얻은 표준편차에 각각 3.143과 10을 곱해 방법검출한계와 정량한계를 산출하였다. 본 실험에서 산출한 방법검출한계는 의약물질의 경우 하천수에서 0.125-7.80 ng/L, 초순수에서 0.028-3.46 ng/L 범위로 나타났으며, 농약류의 경우 하천수에서 0.131-9.30 ng/L, 초순수에서 0.042-1.57 ng/L 수준이었다. 본 결과와 국내외에서 보고된 선행 연구가 공통적으로 나타내는 38종의 검출 한계를 비교하여 Table 4에 나타내었다. EPA method 169415)의 경우 대상물질이 대부분 달라 직접적인 비교는 어려우나, 공통된 4종에 대해 제시한 물 시료에서의 방법검출한계는 0.4-23 ng/L 수준으로 본 연구결과가 더 우수한 것으로 나타났다. 또한 한국 및 중국에서의 선행연구에서 carbamazepine 0.1 ng/L, metformin 2.0 ng/L 및 sulfamethoxazole 0.5-2.0 ng/L 등의 검출한계를 나타내었는데[32,35,36], 본 연구결과(각각 0.265 ng/L, 0.182 ng/L, 0.182 ng/L) 역시 이와 유사하거나 낮은 수준을 보여 미량오염물질의 동시분석법으로서 충분히 적용 가능할 것으로 기대된다.
3.1.3. 매질 효과 평가
국내에서는 식품시료에 한해 매질효과 보정에 대한 기준을 권고하고 있으며, 수질시료에 대한 매질효과 보정에 대한 가이드라인은 제시되지 않고 있는 실정이다[46]. 그러나, 본 연구에서 제시된 43종 분석대상물질의 초순수 및 하천수 시료에서의 방법검출한계를 비교하였을 때 하천수의 검출한계가 다소 높은 점을 확인할 수 있는데, 하천수의 매질 입자에 의한 방해 효과가 시료 분석의 재현성에 영향을 주는 것으로 판단된다. 이에 따라 43종 미량오염물질에 대한 하천수의 매질 효과(matrix effect)를 계산하여 Table 5에 나타내었다. 매질 효과는 표준 용액에서 대상물질의 피크 면적을 전처리 된 하천수에 대상물질을 같은 농도로 첨가하였을 때 검출되는 피크 면적으로 나누어 계산하였다[47]. 그 결과, 본 연구 43종 대상물질들 중 약 21종의 물질은 매질 효과가 크지 않았으나(식품 중 잔류농약 매질효과 허용기준 이내 해당: 80~120%), 나머지 22종의 경우 하천수와 초순수간 수 ng/L 수준으로 검출한계 차이가 나타났다. 이는 실제로 실험의 회수율과 재현성에 매질이 영향을 주는 것을 의미하며, 매질에 따른 검출한계확인이 필요함을 확인할 수 있었다.
3.2. 실제 시료에의 적용
본 연구에서 동시분석 가능성을 확인한 전처리법을 낙동강 유역내 10개 지점의 하천수 시료에 적용하여 오염물질 잔류 수준을 파악하였다. 분석 결과가 검정곡선 농도 범위를 초과한 물질의 경우 해당 물질의 농도 수준에 따라 검정곡선 범위에 포함되도록 시료량을 조절하여 재분석하였으며, 시료 농도가 정량한계 미만일 경우 불검출(Not detected, ND) 처리하였다. 그 결과, 의약물질 21종 중 14종, 농약류 22종 중 11종이 검출되었으며 그 중에서도 특히 metformin (53.1-539 ng/L), telmisartan (ND-855 ng/L), alachlor (11.5-92.6 ng/L)가 고농도로 검출되었다. 본 결과를 선행연구와 비교하였을 때, 2018년 낙동강을 대상으로 한 결과(의약물질 9종, 3-617 ng/L) [33] 및 중국 하천수에서의 결과(의약물질 6종, 23.0-515 ng/L) [22]과 비슷한 농도 수준을 보였으며 2023년 국내 한강, 금강, 영산강, 낙동강 등 4대강 검출 결과(의약물질 19종, 5.0-7076 ng/L)35)보다는 낮은 농도 수준을 보였다.
본 결과를 국외 지표수 수질 기준을 적용하였을 때, 모든 의약물질이 미국 식품의약국 농도 기준(1 μg/L)보다 수십 배 이상 낮은 수준으로 검출되었다. 농약류의 경우 미국 환경보호국의 농도 기준(Atrazine 3 μg/L 및 simazine 20 μg/L)보다 수백 배 이상 낮은 수준으로 검출되었으며, 유럽연합에서 제안하는 먹는물 수질 기준(총 농도 0.5 μg/L 및 개별 농도 0.1 μg/L) 대비 총 농도 기준 4배가량 낮은 결과를 보였다. 그러나, 국내 하천수에서 농도가 보고 사례가 드문 농약류 5종(Alachlor, atrazine, carbendazim, carbofuran 및 diuron)의 경우 농도 수준이 수 ng/L로 낮은 농도 수준을 보였으나, 검출빈도가 40% 이상 높은 빈도로 검출되어 추후 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다.
4. 결 론
수질 시료에서의 신종 미량유해물질인 의약물질 21종 및 농약류 22종에 대한 동시 다성분 분석법 적용 가능성을 평가하고자 다층 카트리지를 활용한 전처리법을 초순수 시료와 하천수 시료에 적용하여 정도관리를 수행하고, 최종 분석방법을 낙동강 시료에 적용하여 잔류수준을 파악하였다. 기기분석 조건 확립 과정 중 본 연구진이 목표한 대상물질이 전반적으로 양호한 감도 수준을 보인 가운데, 의약물질 amoxicillin의 경우 원물질의 불안정성으로 인해 메탄올 부가물을 전구이온으로 설정하여 분석조건을 확립하였다.
분석물질에 대한 정확도 및 정밀도, 회수율 수준은 각각 70.2~121%, 0.1~11.7%, 18.0~127%로 EPA method 1694 기준에 만족하였으며, 방법검출한계 수준은 이전 연구사례와 유사하거나 낮은 값을 나타냈으나, 일부 물질의 경우 매질에 따른 편차도 확인할 수 있었다. 낙동강 하천수 시료에 적용 가능성을 평가한 결과, 대상물질 43종 중 25종이 검출되었으며 metformin, telmisartan, alachlor가 최대 수백 ng/L 수준으로 검출되었다. 본 연구에서 얻어진 농도수준은 전반적으로 국외 수질기준보다 수백~수천 배 이상 낮은 수준을 보였으나, 일부 물질의 경우 40% 이상의 검출 빈도를 보여 지속적인 모니터링이 필요함을 확인할 수 있었다.
본 연구는 다양한 물성을 지닌 미규제 화학물질을 다성분으로 동시에 분석할 수 있는 전처리 및 기기 분석 방법을 확보하고, 이를 낙동강 하천수에 적용하여 평가한 데 의의가 있다. 이 연구 결과는 향후 강화된 국내 하천수 관리 대책 마련에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
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