1. 서 론
우리나라의 저수지는 주로 농업용수 공급을 목적으로 조성되었으나, 산업 구조의 변화와 도시화 과정에서 새로운 역할이 강조되고 있다. 특히, 도시 주변에 위치한 저수지들은 주민들의 여가 활동을 지원하는 중요한 친수공간으로 인식되고 있다. 경기도에는 330여개의 농업용 저수지가 있으며 최근의 환경적 변화에 따라서 단순한 농업용수 공급 시설을 넘어서 시민들의 휴양과 레저를 위한 주요 장소로 발전하고 있다. 그러나 인구의 도시 집중에 따른 오염원 유입 증가 및 기후변화로 인한 수온 상승 등에 따라 열대지방 기원의 새로운 유해종이 유입되거나[1] 유해 남조류의 대량 발생으로 경관이 훼손되고 호수의 남조류 독소가 에어로졸(Aerosol)의 형태로 주변 주민들에게 노출될 가능성도 있다[2]. 미국[3]과 우리나라[4]에서 진행된 연구에 따르면 남조류의 발생(Harmful algal bloom)과 비알콜성(Non-alcoholic) 간질환의 증가사이에 역학적(Epidemical) 인과관계가 존재한다. 또한 우리나라 수계의 클로로필-a 농도와 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 및 파킨슨병(Parkinson’s disease)과 같은 신경퇴행성(Neurodegenerative) 질환의 증가사이에도 통계적인 인과관계가 관찰되었다5). 이러한 신경퇴행성 질환은 남조류가 생산한다고 알려진 BMAA(β-Methylamino-L-alanine)라는 일종의 신경독소가 뇌에 축적되어 발생한다고 추정된다[6].
남조류가 생성하는 독소는 간독소인 Microcystins(MC), Cylindrospermopsin(CYN)과 신경독소로 Anatoxin-a(ANA), Saxitoxin(STX)이 있으며 수생생물이나 세계 공중보건(Global public health)에 위험 요인이 될 수 있다[7]. 농업 분야에서는 씨앗의 발아억제, 농작물의 품질 및 생산성 저하 등이 보고되었으며[8,9], 농산물로 전이된 남조류 독소로 인해 인간의 건강이 위협받을 수도 있다[10]. 우리나라에서는 4가지 속(Genus)의 남조류가 독소를 생산할 수 있는 유해종으로 지정되어 관리되고 있으나 그 속에 속하는 모든 종의 남조류가 독소를 생산할 수 있는 능력을 갖고 있지는 않기 때문에 실제로 해당 독소의 생합성 유전자를 갖고 있으며 독소를 생산하는 지를 확인하는 것이 필요하다.
최근 국내 수계에서 수질, 독소 유전자 및 독소를 종합적으로 연구한 사례는 드물며, 낙동강에서 독소 유전자를 갖는 남조류를 분리하거나[11] 금강에서 Microcystins의 농도가 수온, 클로로필-a 및 남조류 밀도에 강한 상관 관계가 있으며 MC-LR의 비율이 가장 높다는 연구사례[12]가 있을 뿐이다. 이번 연구에서는 경기도 전역에서 다양한 특성을 갖는 17개 주요 저수지를 대상으로 1) 수질분석을 통해 남조류 대량 발생 가능성, 2) 분자생물학적 방법을 이용한 독소 유전자 검출을 통해 잠재적 독소 생산 능력, 3) 독소 정량 분석을 통해 해당 수계의 실제 독소 농도를 파악하였다. 특히 독소 유전자 염기서열 분석을 통해서는 어떤 종류의 남조류가 독소를 생산할 잠재적 가능성이 있는지도 알아낼 수 있다. 따라서 이번 연구결과는 유해 남조류 발생으로 인한 피해 가능성 예측 및 저수지 관리에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
2. 재료 및 방법
2.1. 대상
조사 대상으로는 경기도에 위치한 총 저수용량 200만 톤 이상의 저수지 17개소를 선정하였다(Fig. 1). 지역별 분포는 안성시(5개소), 용인시(2개소), 파주시(2개소), 화성시(2개소), 군포시(1개소), 남양주시(1개소), 수원시(1개소), 여주시(1개소), 의왕시(1개소), 평택시(1개소)이다. 이들은 상수원수와 농업용수 공급 및 친수공간으로 이용되고 있으며 대체로 다음과 같이 구분할 수 있다. 국가수질 측정망(기흥, 고삼, 광교, 이동, 남양), 상수원(광교), 경기도 생물측정망(덕우, 금광, 왕송), 경기도 중점관리 저수지(반월, 남양, 왕송), 낚시터 등으로 활용(두메, 금사, 기천, 마둔, 마장, 마지, 오남, 용설)되거나 관리되며 각각 인근의 산업단지, 축산농가, 주거지역으로부터 다양한 오염원이 유입되고 있다. 분석대상 시료는 2023년 3월부터 11월까지 10~13시 사이에 지점에 따라 5~8차례 표층에서 채취하였다.
2.2. 실험방법
2.2.1 수질분석
3월부터 11월까지 저수지에 따라 5~9회에 걸쳐 다항목 수질측정기(YSI ProDSS)를 이용해 현장에서 수온(Temp.), 용존산소(DO), 전기전도도(EC), pH를 측정하였고 실험실에서는 수질오염공정시험기준에 따라서 총질소(TN), 용존성 총질소(DTN), 총인(TP), 용존성 총인(DTP), 클로로필-a(Chl-a), 총 유기탄소(TOC), 용존성 총 유기탄소(DTOC)를 분석하였다. 수질분석 결과는 한국형 부영양화지수(TSIKO) 산정과 클로로필-a와 다른 수질인자 사이의 상관관계 분석에 활용하였다. 이번 연구에서는 유기물 영향을 반영하는 수질항목으로 COD 대신에 TOC를 선택하여 분석하였다. 이는 우리나라에서 2013년부터 호소생활환경기준으로 TOC 항목이 적용되어 유기물질 지표로 활용되고 있으며 전기전도도가 700 ㎲/㎝ 이하인 담수호의 경우에는 TOC를 이용하는 것이 가능하다는 연구 결과[13]를 바탕으로 하였다. 한국형 부영양화지수는 TOC, TP, 클로로필-a 농도를 이용하여 월별로 계산한 후 평균값을 구하였고 계산식은 다음과 같다.
TSIKO(TOC) = 17.9 + 64.4log(TOC, mg/L)
TSIKO(Chl) = 12.2 + 38.6log(Chl, mg/m3)
TSIKO(TP) = 114.6 + 43.3log(TP, mg/L)
TSIKO = 0.5TSIKO(TOC) + 0.25TSIKO (Chl) + 0.25TSIKO(TP)
2.2.2. 독소 유전자 분석
DNA를 추출하기 위해 시료를 0.45 μm pore size filter(Pall, USA)를 이용해 최대한 가능한 양을 여과한 후 여지는 초저온 냉동고(−80oC)에 보관하였다. 이후 DNeasy PowerWater kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 가이드라인에 따라 여지로부터 DNA를 추출하였다. 독소 유전자를 확인하기 위해서 AccuPower Taq PreMix(Bioneer, Korea)에 각 독소 유전자의 특이적 forward/reverse primer (Table 1) 1 μL, DNA 2 μL와 멸균 증류수 16 μL를 첨가하여 총 20 μL로 각각의 PCR 반응을 수행하였고, 자동전기영동장치(Thermo, USA)로 증폭산물을 확인한 후 anaC와 aoaB를 대상으로 염기서열을 분석하였다(Bionics. Korea).
2.2.3. 독소 분석
시료는 독소물질의 변화를 최소화하기 위해 갈색 유리병에 채취하여 4oC이하에서 실험실로 운반하였다. 조류 세포내(Intracellular)와 용존(Dissolved) 독소를 동시에 측정하기 위해 시료 10 mL를 분취하여 초음파 분쇄기를 이용해 30분 동안 조류 세포를 파괴하였다. 이후 처리된 시료를 0.20 μm PTFE 시린지(Syringe) 필터를 이용하여 여과한 후 여과액을 분석시료로 하였다. 분석장비는 LC-MS/MS(Ultra 3000/Q-Exactive, Thermo, USA)이며 online SPE 시스템이 장착되어 있으며 Microcystins-LR, -RR, -YR, Anatoxin-a, Cylindrospermopsin을 분석조건(Table 2)에 따라 동시 분석하였다. 분석대상 조류독소의 검출한계(LOD, μg/L) 및 정량한계(LOQ, μg/L)는 각각 MC(0.02, 0.05) ANA(0.01, 0.04) 및 CYN(0.01, 0.05)이다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 수질특성 및 영양상태
연구 대상 17개 저수지의 전반적인 수질특성을 파악하기 위해 전기전도도, TN, TP(영양물질), TN/TP, Chl-a(조류), TOC(유기물)의 히스토그램 분석을 수행하였다(Fig. 2). 6개 항목 모두 평균값보다 중앙값(Median)이 작으며 오른쪽으로 치우친 양의 왜도(Skewness) 값을 가진 것으로 나타났다. EC(전기전도도)의 평균값은 281.4 μs/cm이며 3월~7월의 남양호를 제외하고는 700 μs/cm 이하로 대상 저수지들은 담수호로 볼 수 있다. TN은 평균 1.748 mg/L(0.515~6.476 mg/L)로 이는 과영양 기준인 1.5 mg/L [14]를 넘어서 대부분이 부영양~과영양 상태이며 DTN/TN은 평균 86.7%(31.7~99.5%)였다. TP의 평균값은 0.0383 mg/L(0.001~0.218 mg/L)로 OECD 등의 부영양 기준이 0.02~0.035 mg/L임을 고려할 때[15] 조사 대상 저수지의 평균 TP의 농도는 그 수준 이상이다. DTP/TP는 평균 49.9%(0~90.9%)로 DTN/TN에 비해서는 매우 낮았다.
우리나라의 호소 생활환경기준에서는 TN/TP가 16 이상이면 질소를 적용하지 않는 것으로 규정하고 있다. TN/TP는 월별로는 기준이 되는 16 이하인 경우도 있지만 연 평균으로는 모든 저수지에서 16을 초과해서 조류 발생은 주로 TP 농도에 따라 제한되는 것으로 판단된다. 클로로필-a의 평균값은 23.3 mg/m3(1.8~156.5 mg/m3)로 일본[16]에서 제시된 부영양 기준 10 mg/m3의 2배 이상이다. TOC의 평균은 3.8 mg/L(1.3~10.5 mg/L)이며 DTOC/TOC는 평균 86%(39.2~100%)이였다.
한국형 부영양화지표는 빈영양(1), 중영양(4), 부영양(11)와 과영양(1)로 나타나 대부분의 저수지가 조류 발생에 매우 취약한 것으로 나타났다. 또한 저수지별로 조류 발생 지표인 클로로필-a와 수온(Temp.), DO, pH, EC, TN, DTN, TP, DTP, TOC, DTOC와의 상관관계 분석에서 수온, DO, pH, TP, DTP, TOC, DTOC는 대부분의 저수지에서 양의 상관관계를 가지지만 EC, TN, DTN는 음의 상관관계에 있는 저수지가 더 많은 것을 볼 수 있다(Fig. 3). 클로로필-a와 다른 수질인자 사이의 상관관계는 다양한 조건에 따라 다르게 나타난다. 수온과 인(P)은 조류의 성장을 촉진하는 인자이며 DO. pH, TOC는 조류의 증식에 따라서 증가한다고 판단된다. 대부분의 지점에서 음의 상관관계를 나타낸 TN과 DTN은 낙동강 보 구간에서 TN 및 nitrate가 높은 음의 상관관계를 나타낸 것과 같이 조류의 성장과 함께 감소하기 때문으로 보인다[17].
mcyA anaC와 aoaB는 각각 Microcystins, Anatoxin-a와 Cylindrospermopsin 생합성에 관여하며 이들 유전자를 갖는 남조류는 해당 독소를 생산할 수 있는 능력을 갖고 있다고 할 수 있다. 독소 유전자 지표 및 독소 검출에 따른 mcyA-(mcyA 음성), mcyA+(mcyA 양성), MC+ (Microcystins 양성) 및 anaC-(anaC 음성), anaC+(anaC 양성) 집단사이의 평균 클로로필-a 농도에 차이가 있는지 알아보기 위해 mcyA 지표에 대해서는 일원배치분산분석(one-way ANOVA)와 Tukey의 Honesty Significant Difference(HSD) 검증, Anatoxin-a의 anaC 지표에 대해서는 T-test를 수행하였다. 결과는 mcyA - mcyA+ 및 MC+ 세 집단 사이에 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 나타냈다. F(2.66) = 5.781, p<0.05(p=0.0038). 이후 각 집단 간의 차이를 확인하기 위한 Tukey’s HSD test를 이용하여 사후 분석을 수행하였다. 결과적으로 mcyA+와 mcyA- 및 MC+의 평균 클로로필-a 농도는 각각 p<0.05 (평균차이: 15.22, p-adj = 0.021)와 p<0.05(평균차이: 20.77, p-adj = 0.004)로 95% 신뢰수준에서 차이가 있었다. 그러나 mcyA+와 MC+ p>0.05(평균차이: 5.55, p-adj = 0.592)로 집단 사이에서는 평균 클로로필-a 농도에 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한 anaC-와 anaC+ 집단 사이에서는 T-통계량 값: −2.569, p<0.05(0.0017)로 신뢰수준 95%에서 평균 클로로필-a 농도는 통계적으로 유의미한 차이가 있었다. 이러한 결과는 특정 독소 유전자 지표와 독소의 존재 여부가 클로로필-a의 농도와 관련이 있음을 시사하며, 이는 독소 생성과 관련된 유전자 및 독소가 존재할 때 클로로필-a의 농도가 높은 경향이 있다는 것을 보여준다.
3.2. 독소 합성유전자의 시공간적 분포 특성
이번 조사에서는 우리나라에서 먹는물 감시항목으로 지정된 Microcystins(MC) 뿐만 아니라 Anatoxin-a(ANA) 및 Cylindrospermopsin(CYN) 유전자 지표도 다양한 시기와 저수지에서 검출되었다(Table 3). Microcystins는 전세계적으로 담수계에서 발견되는 가장 흔하고 높은 농도로 존재하는 남조류 독소로 간에 독성을 유발하며 mcy(A-J) gene cluster에 의해 생합성 된다[18]. 이 중에서 mcyA, mcyB, mcyD, mcyE 등이 독성 남조류의 유전자 지표로 활용될 수 있으며[19] mcyA를 이용한 국내 수계에서 수행된 연구에서는 대청댐, 충주댐, 소양댐 등에서 모두 Microcystis에서 유래한 지표만 검출된 적이 있다[20]. 이번 조사대상 17곳의 저수지 가운데에서는 두메, 마둔, 오남 저수지를 제외한 14곳과 총 111건의 시료 중에서 72차례(64.9%) 검출되었다. 수온(9.2~11.3oC)이 낮은 3월부터 반월, 덕우, 기천, 금광, 남양 저수지에서 검출되기 시작하여 6월부터는 앞서 언급한 3개의 저수지를 제외하고 모든 지점에서 검출되었다. Microcystis는 주로 여름철에 활발하게 증식하지만, 한번 발생하면 수온이 낮아지고 현존량이 감소해도 독소 유전자는 지속적으로 검출되는 것으로 보인다.
Anatoxin-a는 캐나다 호수에서 분리된 Anabaena flosaquae에서 발견된 신경 독소이며 ana(A-G) gene cluster에 의해 생합성 된다[21]. Anatoxin-a의 유전자 지표인 anaC는 11곳의 저수지와 21차례(18.9%) 검출되어 mcyA에 비해서는 현저히 낮았지만, 국내 저수지에 일정 수준으로 분포하고 있는 것으로 판단된다. 수온이 3.9~21.3oC인 4월부터 금사, 기천, 마장, 오남 저수지에서 검출되었으며, 유전자 염기서열 분석 결과 최적 생장 온도가 15~20oC로 알려진 Oscillatoria sp.가 이 시기에 Anatoxin-a의 주요 생산자일 것으로 추정된다. 이후 수온이 증가하는 7월~9월까지 검출율이 증가하였으며 특히 금광, 고삼, 이동, 남양, 왕송 저수지에서는 여름철에 지속적으로 존재하고 있어서 Cuspidothrix issatschenkoi, Aphanizomenon sp.와 계통학적으로 유사한 남조류 종이 존재하는 것으로 생각된다. 하지만 mcyA와는 달리 수온이 낮은 3월과 11월에는 모든 지점에서 검출되지 않았으나, 조사 대상 저수지에는 Anatoxin-a 생산이 가능한 남조류 종이 수온과 지점에 따라 다양하게 분포하고 있는 것으로 나타났다.
Cylindrospermopsin은 신장, 간, 비장, 심장 등에 독성을 유발하는 남조류 독소로 aoa/cyr gene cluster에 의해 생합성 된다[22]. 이 독소를 생성하는 남조류는 대표적으로 열대 기원의 Raphidiopsis raciborskii이 있으며, 2018년에 국내에서는 처음으로 인천지역의 저수지에서 분리되었으나 독소 유전자를 갖고 있지 않았다[1]. 이후 Cylindrospermopsin의 유전자 지표인 cyrJ가 화성시 멱우 및 안성시 금광 저수지에서 검출된 적은 있으나, 독소 합성 유전자를 보유한 남조류가 분리되지 않았다. 이번에 유전자 지표로 사용된 aoaB는 5곳(반월, 덕우, 두메, 마둔, 광교)의 저수지에서 수온이 높은 7월부터 검출되기 시작했으며, 특히 안성시에 위치한 두메 저수지에서는 Microcystins와 Anatoxin-a의 유전자는 전혀 검출되지 않았지만, aoaB는 전 기간동안 꾸준히 검출되었으며 염기서열 분석결과 Raphidiopsis curvata, R. raciborskii, Aphanizomenon sp.와 100% 일치하였다. Cylindrospermopsin의 지표인 aoaB는 12차례 10.8%의 검출율을 보여서 대상 독소 유전자 가운데에서는 가장 낮았다.
3.3. 남조류 독소 검출 특성
Microcystins의 유전자 지표인 mcyA는 수계 내에서 여름철 짧은 시기에 집중적으로 발현하기 때문에 유전자 지표와 독소 농도의 변화는 유사한 특성을 보이며 남조류 세포 밀도와 통계적으로 유의한 상관성이 존재한다[23]. 이번 연구에서는 Microcystins는 mcyA 유전자가 양성인 72차례 가운데 34차례 검출되어 평균적으로 47.2%의 검출율을 보였다. 수온이 높은 8월(24.8~33.1oC) 50%, 9월(24.2~28.7) 86%로 높은 검출율을 보이다가 11월(11.1~18.9oC) 41%로 감소하였다. 3월(7.7~14.8oC)~5월(17.3~20.7oC)에는 검출되지 않았으나 6월(21.4~26.7oC)에 0.085~1.278 μg/L, 수온이 높은 여름철에 최고 농도 24.213μg/L를 기록하였다. mcyA 유전자 지표는 3월부터 존재하였으나 독소는 6월부터 검출되기 시작했다. 이는 빠르게 생장하는 Microcystis aeruginosa 세포내 독소 함유량이 높아진다는 것과 일치하는 결과이다[24], 총 Microcystins의 농도는 3개 종(Congeners)의 합이며 저수지마다 다르지만 각 종의 점유율은 평균적으로 MC-LR>MC-RR>MC-YR 순서였다. MC-LR과 MC-RR은 거의 비슷한 점유율로 대부분을 차지하였고, MC-YR은 총 농도가 낮을 때 10.8~100%의 점유율을 갖는 경우도 있었지만 불검출 되는 저수지가 많았다(Table 4). 평균 점유율의 차이를 분석하기 위한 T-test 결과, T-통계량 값은 1.243, p>0.05(p=0.226)로 두 집단의 평균은 통계적으로 차이가 없었다. 이러한 결과는 국내 대부분의 호소에서 MC-RR의 농도가 가장 높으며 대청호, 소양호, 팔당호에서 분리된 Microcystis가 MC-RR과 MC-YR만을 생산할 수 있다는 이전의 조사와는 다른 것이다20). 캐나다의 온대와 아한대(Boreal) 지역의 440개 호수에서는 MC-LR>MC-YR>MC-RR 순서로 검출되었으나, 국내 수계에서는 낮은 비율의 MC-YR이 상대적으로 많이 검출된다[25]. 또한 미국 이리(Erie)호에서는 질소원이 풍부하면 질소의 함유량이 높은 MC-RR이 우세하며 질소가 제한된 환경에서는 질소의 함유량이 낮은 MC-LR과 MC-LA가 증가한다고 한다[26]. 국내 수계는 대체로 질소가 풍부하기 때문에 MC-RR이 우세할 것으로 예상할 수 있으나 기후변화에 따라 국내 수계에서 MC-RR의 5배 정도 독성이 강한 MC-LR을 생산하는 종의 점유율이 증가할 가능성이 있다.
Anatoxin-a는 anaC가 출현한 21차례 중에서 2차례만이 검출되어서 9.5%의 낮은 검출율로 농도는 0.050~0.073 μg/L였다. 과거 대청호에서 0.01~0.08 μg/L의 농도로 검출된 적이 있으나[27] 국내에서는 아직 Anatoxin-a 생산능력을 갖는 남조류는 분리된 적은 없다. Cylindrospermopsin은 aoaB 유전자가 12차례 출현하였지만 독소는 검출되지 않았다. 5개 저수지에서 유전자가 검출되었으며 안성시에 위치한 두메 저수지에서는 연중 검출되어 국내 환경에 적응한 남조류가 존재하는 것으로 추정되어 더 세밀한 조사가 필요한 것으로 판단된다.
이번 연구에서는 남조류 독소 유전자 검출에 대한 실제 독소 검출율이 Microcystins(47.2%), Anatoxin-a(9.5%), Cylindrospermopsin(0%)로 나타났다(Table 3). 이는 남조류 독소 유전자가 담수계에서 남조류 발생시기에 독소 생성의 강력한 지표이지만28) 전체 합성 유전자 cluster 가운데에서 mcyA, anaC, aoaB와 같이 하나의 유전자 지표 검출로 실제 독소 발생 유무를 판단하는 것은 어렵고[29], 독소 유전자의 발현은 복잡한 메커니즘 및 환경요인에 따라 영향을 받기 때문이다[30]. 하지만 궁극적으로 기후변화로 인해 담수계에서 독성 남조류로 인한 위험이 증가하고 있는 것은 사실이다[31].
4. 결 론
본 연구에서는 경기도내 17개 저수지를 대상으로 수질 및 남조류 독소인 Microcystins, Anatoxin-a, Cylindrospermopsin의 합성 유전자 지표를 검출하고 해당 독소를 분석하였다. TN, TP, 클로로필-a는 평균적으로 외국의 기준에서 부영양~과영양 수준이었다. 한국형 부영양화지수도 대부분 부영양 단계 이상으로 남조류 발생에 매우 취약한 상태로 나타났다. 조류의 지표인 클로로필-a는 TP, TOC와는 대체로 양의 상관관계를 갖지만 TN과는 음의 상관관계를 갖는 저수지가 많았다.
Microcystins의 합성 유전자 지표인 mcyA는 14개 저수지에서 검출되었고 검출율은 64.9%(72/111)에 달했다. 독소의 검출율은 47.2%(34/72)이며 수온이 높은 여름철에 검출율과 농도가 증가하는 경향을 보였다. Microcystins의 종(Congeners)별 점유율은 평균적으로 MC-LR>MC-RR>MC-YR이지만 MC-RR의 점유율이 더 높은 저수지가 있어서 MC-LR과 MC-RR은 비슷한 수준이었다. 이는 MC-RR의 점유율이 높았던 국내 기존 연구결과와는 다른 것이다. Anatoxin-a의 합성 유전자 지표인 anaC는 11개 저수지에서 검출되었고 검출율은 18.9%(21/111), 독소의 검출율은 9.5%(2/21)이며 검출농도는 0.050~ 0.073 μg/L였다. Cylindrospermopsin의 합성 유전자 지표인 aoaB 5개 저수지에 검출되었고 검출율은 10.8%(12/111)이며 독소는 검출되지 않았다. 이번 연구결과는 경기도내 저수지에는 지속적으로 주요 남조류 독소 합성 유전자가 존재하며 독소도 검출되고 있어서 향후 기후변화와 같은 환경변화에 따라 남조류 독소에 의한 피해 가능성은 더욱 증가할 수 있다는 것을 시사한다.
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