Analysis of Total Microcystins using LC-MS/MS: Assessment of Pretreatment Technique for MMPB(2-methyl-3-methoxy-4-phenylbutyric acid)

Min-Jeong Kim; Jae-Won Choi

doi:10.36278/jeaht.27.2.90

ABSTRACT

Algal toxin analysis, particularly for microcystin (MC) variants, is commonly performed using LC-MS/MS as the standard method. In 2016, the environmental protection agency (EPA) published method 546 for the determination of total MCs by ELISA. However, the limited availability of commercial algal toxin standards limits the efficacy of the LC-MS/MS method. This study proposes a novel approach using the 2-methyl-3-methoxy-4-phenylbutyric acid (MMPB) structure generated by oxidizing MCs with potassium permanganate and sodium periodate. MMPB is formed through the oxidation of the common (all-S,all-E)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid (ADDA) structure, eliminating the need for specific standard materials for each MC variant. This provides a method for measuring the total MCs. This study focused on optimizing sample pretreatment before oxidation, salt removal as a post-oxidation step, and the quantitative method to establish a comprehensive total MC detection approach applicable to surface water samples. The whole process included pretreatment using a freeze-drying method, purification using liquid-liquid extraction (LLE) for salt removal, and a comparison of quantitative methods using internal standards. Additionally, an evaluation of internal standards was conducted to assess availability during the oxidation process. In this study, an MMPB recovery rate of up to 50% was achieved, with an analysis precision of 14%. According to the results of QAQC, the satisfactory linearity of the calibration curve was a precision and the performance of the method for spiked samples was verified. The MMPB analysis method developed in this study showed relatively lower quantification limits and recovery rates than individual MC analysis methods. We believe these results stem from the inherent sensitivity differences between MCs and MMPB, as well as the complexity of the pre-treatment process centered around the oxidation process.

Key Words: cyanobacteria, total microcystins, MMPB, LC-MS/MS

1. 서 론

환경부는 2013년 남세균(cyanobacteria)이 생성하는 간 독소물질인 마이크로시스틴(microcystin, MC) LR을 먹는물 감시항목으로 지정하였으며, LC-MS/MS를 이용한 MC-LR 분석법을 공인시험기준으로 제정하였다[1,2]. 이후, 23년부터 MC-LR 뿐만 아니라 RR, YR, LA, LY, LF 등 총 6종으로 감시항목을 확대하여, MC 6종의 합계 농도 1µg/L 이하로 기준이 개정되었다[3]. MC는 자연에 약 270여종이 존재 가능한 것으로 보고되어 있으며[4], 현재 표준 분석법인 LC-MS/MS 법은 각각의 대응하는 표준물질을 사용하여 정량하는 방법으로 시판되는 MC 표준물질의 종류가 약 15종 전후로 한정되어 있어, 총 마이크로시스틴(Total microcystin, MCs) 농도를 측정하는 것은 제한적이다.

한편, 국내에서 보고된 MC 변이체(variants)는 LR, YR, RR 등을 포함한 4~5종으로 알려져 있어, 시판되는 표준물질을 이용한 총 농도 측정이 가능하다. 공정시험 기준에 따른 분석은 초음파를 이용해 남세균이 포함된 시료를 추출하고, 고상 추출 정제(SPE) 등의 전처리 과정을 거쳐 LC-MS/MS에서 분석하는 방법이다. 미국환경보호청(US EPA)은 LC-MS/MS 뿐만 아니라 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 이용하여 MCs를 분석할 수 있도록 측정방법의 선택가능성을 부여하였다. 현재 국내에서 물 이외 시료의 MCs 표준분석법은 존재하지 않아, 어류, 퇴적물과 같이 다양한 물환경 시료에 대한 표준분석법의 필요성은 대두되어왔다. 특히, 최근 보도에 따르면 작물에서 MC의 검출 등의 보도가 있어, 수질 이외의 MCs 표준 분석법 제시의 필요성도 대두되고 있다[5].

다양한 MC 변이체를 산화 후 단일 성분을 확보하여 LC-MS/MS로 정량하는 방법은 90년대 후반부터 보고되었다[6]. 이 성분은 2-methyl-3-methoxy-4-phenylbutyric acid(MMPB)로 명명되며 MC의 Adda(the abbreviation for (all-S,all-E)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid) 구조가 과망간산포타슘과 과아이오딘산소듐으로 산화되어 생성되는 공통 구조의 산화물로서 모든 개별 표준물질을 갖추지 않아도 총 마이크로시스틴 농도를 측정할 수 있다는 특성이 있다[7, 8] (Fig. 1). 선행연구는 다양한 시료에 적용하기 위해 MMPB 산화조건을 비교, 검토하였으나, 대부분 공통적인 시약과 일정한 반응시간 범위로 보고되어 있으며, 산화시약의 정제 후 기기 분석하는 절차를 따른다. 선행 연구 중, 물환경 녹조 조체 중에 적용한 사례[9]가 있을 뿐, 현재까지 물 시료에 대한 분석용 표준절차 보고 사례는 부재인 것으로 사료되었다.

본 연구에서는 수질에서 MMPB 산화를 이용한 LC-MS 기반 MCs 정량법 구축을 위해 액상시료를 대상으로 한 전처리 방법을 비교 평가하였다. 사전 검토에서 MMPB 산화조건은 문헌조사와 예비 실험을 통해 공통 조건을 확인하였고 LC-MS/MS 조건은 보유 장비의 분석 조건을 확인하였다. 본 연구에서는 주로 수질 시료의 사전 농축법 및 산화 후 정제 조건 비교와 정도보증용 표준물질의 적합성을 검토를 통해 수질의 MMPB 분석 절차 마련을 시도하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. 표준물질 및 시약

산화처리를 위해 MC-LR(Cas No. 101043-37-2), RR(111755-37-4), YR(101064-48-6), LA(96180-79-9), LF(154037-70-4), LY(123304-10-9) 표준품 및 nodularin(118399-22-7)의 표준물질을 ENZO Life Sciences에서 구입하였으며, MMPB는 TCI에서 구입하여 사용하였다. 내부표준물질로 사용하는 4-phenylbutyric acid(4-PB, Cas No 1821-12-1)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. LC-MS/MS 분석에 사용하는 메탄올은 SigmaAldrich에서 구입하였으며, 분석에 사용한 증류수는 MS용 water를 Supelco에서 구입하여 사용하였다. 각 표준물질은 일정 농도로 50% 메탄올에 희석하여 분석에 사용하였으며, 동결건조 후 산화처리과정에 사용하였다.

2.2. 산화 처리과정과 농축·정제

MC을 산화하기 위해 연구 문헌에 제시된 조건을 바탕으로 사전 예비실험을 통해 전처리 시간, 기기분석 시간 등을 고려한 공통의 표준절차를 수립하였다(Table. 1). 산화 처리는 과망간산포타슘(KMnO₄)과 과아이오딘산소듐(NaIO₄)을 이용하여 진행하였다. 탄산포타슘(K2CO3)을 이용하여 추출액의 pH를 7 이하로 조절하였다. 산화제는 각각 50 mM의 농도로 제조 및 사용하여 어두운 상온에서 2시간 동안 산화하였다. 다음으로, 40% 황화수소소듐(NaHSO₄)를 이용하여 반응을 정지하였다.

연구 문헌에서 대부분의 시료는 직접 산화보다 농축 상태로 수분을 거의 포함하지 않은 상태에서 산화를 실시하였다. 본 연구는 산화 전 시료의 농축 과정에 대해 비교 실험을 진행하였다. 시료 농축 방법으로는 질소(N₂) 가스 건조, 열 건조, 동결 건조 세가지 방법을 사용하였다. 열건조는 오븐에서 40oC 내외의 온도로 진행되었으며, 동결건조는 −85oC 이하에서 48시간 이상 진행하였으며, 질소가스는 농축기에서 완전 건조되도록 가스를 주입하였다.

산화 후 염 제거를 위해 고체상 추출법(Solid Phase Extraction, SPE)와 액체-액체 추출법(Liquid-liquid Extraction, LLE) 방법이 비교되었다. SPE 과정은 HLB 카트리지(OASIS)를 사용하여 진행되었으며, 메탄올 10 mL, 증류수 10 mL를 이용하여 카트리지를 세척 후 산화처리한 시료 주입하여 질소가스로 카트리지를 건조하였고 추출은 메탄올 6 mL로 진행하였다. 이후 용출된 메탄올을 질소가스로 완전 건조하여 30% 메탄올 1 mL를 이용해 재용리 후 분석하였다. LLE 과정은 과포화 염화소듐(NaCl) 용액을 100 µL 첨가한 후 ethyl acetate를 1 mL 첨가하여 추출하였다. 이후 시료는 N₂ 가스를 이용하여 농축하고, 30% 메탄올에 재용리하여 기기분석하였다.

정도보증용 표준물질로 사용한 4-PB는 시료의 전처리 전, 산화 처리 전, 기기 분석 전에 주입하였으며, 산화과정 전후의 결과를 통해 적합성을 확인하였다. 또한, 정량을 위해 MMPB 표준품을 이용한 정량과 MC 6종의 표준품을 산화하여 이용한 정량방법을 사용하였다.

2.3. 검정 곡선

정량하기 위한 검정곡선 제조는 두 가지 방법으로 이루어졌다. 시료 농축 과정(3.1 참조)과 산화 후 정제 방법(3.2 참조)을 비교하는 실험에서는 시판되는 MMPB를 정량에 사용하였다. 이후, 산화 전과정을 반영한 정도보증용 표준물질 평가 및 정도관리는 MC 6종(MC-LR, RR, YR, LA, LF, LY) 혼합표준품을 산화하여 얻은 MMPB 검정곡선으로 실시하였다. MC 6종은 본 연구에서 구축한 산화과정을 모두 거쳐 분석하였으며, 6종 농도를 합산한 값으로 변환하여 계산하였다.

2.4. 기기분석

Triple Quad LC-MS/MS는 Shimadzu의 ExionLC 및 SCIEX의 QTRAP 6500+(AB SCIEX)를 이용하였으며, 분석 컬럼은 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (2.1 × 50 mm, 4-Micron, Agilent)을 사용하였다. Multiple reaction monitoring(MRM) mode에서 MMPB, 4-PB를 분석하였다. 이 외의 기기 분석 조건은 Table 2에 기재하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 산화 전 시료 농축 방법 비교

MMPB 방법을 적용한 선행연구에서 어류[16], 녹조[9] 등 다양한 적용사례가 보고되었다. 수질을 대상으로 분석 전과정을 보고한 사례는 거의 없으며, 자체적인 사전 예비 실험에서 일정 양의 물에 산화제를 적용하면, 측정값 간의 차이가 매우 큰 결과를 관찰하였다. 이 점은 추출물을 산화한 사례들과 달리 수질 분석에 제한점으로 판단되었다. 이에, 물 시료는 산화 전단계에 농축하여 건고(dry) 상태에서 산화 반응을 일으켜 MMPB 구조로 전환하는 것이 타당할 것으로 추론하였다.

수질 시료 농축 방법은 N₂ 가스, 오븐 가열, 동결 건조 조건을 검토하여 오븐에서의 농축을 제외하고 N₂ 가스와 동결 건조 방법을 비교하였다. 일정량의 MMPB 표준품 및 MC-LR을 정제수 10mL에 첨가 후, 두 방법으로 농축하고 산화 등 전처리를 거쳐 MMPB 값을 비교하였다. 이 때 비교를 위한 검정곡선은 시판의 MMPB를 이용하여 전처리 과정을 생략하고 정량하고, 결과는 Fig. 2에 제시하였다.

MMPB를 직접 첨가한 경우, 농축 방법에 따른 차이는 보이지 않았으나, MC-LR을 첨가하여 산화 전처리가 포함된 경우는 농축 방법 간에 2배 이상의 차이가 관찰되었다. 우선 전자의 경우 MMPB에 대한 사전 농축 방법간 차이는 없을 것으로 판단되나, MC 첨가에서 동일한 산화 반응을 가정하면 N₂ 가스 농축 과정 장시간의 소요 및 함께 첨가된 메탄올 기화 등의 영향으로 MC의 소실이 일어난 것으로 추정되었다.

또한 정량적 비교를 통해 MC-LR의 MMPB 전환 효율은 MMPB 표준품 적용 결과에 비해 유의하게 저하하는 것이 관찰되어 물시료의 MMPB 정량은 검정곡선과 시료에 동일한 전처리 과정이 반영되어야 함을 시사하였다. 동결건조에 소요되는 적정 시간 및 MMPB의 감도를 고려하여 시료의 농축 용량은 10mL로 결정하였다.

3.2. 산화 후 정제 방법 비교

산화 과정에서 사용된 KMnO₄, NaIO₄, NaHSO₄ 시약에서 유래하는 염류는 LC-MS/MS의 이온화 효율을 방해하거나 기기 고장의 원인이 된다. 염 제거를 위해 고상추출(SPE)과 에틸아세테이트를 이용한 액-액 추출(LLE) 방법을 비교하였다. 첨가 대상은 MC-LR을 10 mL에 10 ng/ml 이 되도록 주입 후 산화하고 각 방법별로 정제하여 LC-MS/MS로 정량하였다. 정제 방법간 상대적 비교를 위해 정량에 사용한 검정곡선은 시판 MMPB를 사용하였다.

측정 결과, LLE 방법은 SPE보다 상대적으로 약 2배 높게 회수되었으며(34.3%, 15.7%), LLE 방법의 상대표준 편차는 큰 편으로 나타났다 (Fig. 3). 이는 ethyl acetate를 1 mL 사용하여 추출하는 과정의 기술적 한계로 판단되나, HLB 카트리지를 적용한 SPE 과정보다 회수율이 높고 경제적인 절차로 판단되었다. 이 실험에서도 첨가량보다 낮은 측정값의 사유는 시판 MMPB를 전처리 전과정 없이 직접 검정곡선으로 사용하였기 때문으로 추정하였다.

3.3. 정도보증용 표준물질(4-PB)의 적합성 확인 및 정도관리 결과

MMPB 정량 분석에서 주로 사용하는 정도 보증 표준 물질은 MMPB-d3와 4-PB이며, 전자의 경우 매우 고가에 시판되므로, 4-PB를 선정하여 각 단계별로 첨가 후 분석을 통해 대체표준물질 및 내부표준물질로서의 특성을 비교하였다. 4-PB는 시료 동결건조 전, 산화 처리 전, 기기분석 전 단계에서 각각 500 ng/mL가 되도록 첨가하여 분석하였다. 단계별 크로마토그램을 비교한 결과, 4-PB는 산화 과정을 거치면서 피크의 감도가 현저히 낮아져 분해 소실이 일어나는 것으로 확인되었다(Fig. 4의 a, b). Foss와 Aubel [13]은 4-PB를 산화전에 첨가한 것으로 보고하였으나, 본 연구에서는 산화 시약에 대해 4-PB가 안정적이지 않아 기기분석 전 재용리 단계에 내부표준물질로서 첨가가 타당할 것으로 판단되었다(Fig. 4의 c). 이 방법의 대체표준물질은 MMPB-d3(erythro-2-methyl-3-(methoxy-d3)-4-phenylbutyric acid)가 적합할 것으로 사료되어 추후 연구에서 추가 적용이 필요하다.

지금까지 정립한 절차는 Fig. 5로 요약되며 이 절차를 이용하여 주요 MC 6종(LR, RR, MC YR, LA, LF, LY)의 혼합 표준품을 3~60 ng/mL 범위가 되도록 10 mL에 첨가한 검정곡선을 전과정 전처리하여 작성하고, 6 ng/mL 첨가 시료를 이용하여 정도관리를 진행하였다. 이 조건에서 검정곡선의 직선성 계수 R² 값은 0.9961 이며(Fig. 6), 첨가 시료는 정량한계 4.27 ng/mL, MMPB로서의 회수율 50.3%, 정밀도는 14.1%로 나타났다.

4. 결 론

조류독소 중 마이크로시스틴 분석 방법은 LC-MS/MS를 이용한 성분별 정량 분석법이 표준절차로서 널리 사용되고 있으나, 시판 표준물질의 제한적인 공급으로 인해 마이크로시스틴 총량 분석에 기술적 한계가 존재하여 이를 보완하고자 Adda 구조의 산화 처리를 통한 MMPB 단일 성분 정량법 정립을 국내 첫 사례로 시도하고 시료 적용 전에 예비 성능을 검토하였다.

전처리 과정은 시료의 사전 농축 방법으로서 동결건조, 산화 처리 절차, 염 정제로서 LLE, 내부표준물질 첨가 조건 등을 실험적으로 확인하였으며, MMPB 정량은 시판 표준품 적용보다 마이크로시스틴 혼합물을 적용한 전과정 전처리 검정곡선법을 제안하였다.

정도관리 시험 결과, 정립한 방법은 양호한 검정곡선 직선성 확인 및 첨가 시료에 대한 성능을 확인하였다. 본 연구에서 정립한 MMPB 분석방법에 의한 성능은 개별 마이크로시스틴 분석법에 비해 정량한계, 회수율 성능 등은 상대적으로 낮으며 이는 마이크로시스틴과 MMPB의 감도 차이 및 산화 과정을 중심으로 한 전처리의 복잡성에 기인한 것으로 사료되었다.

감사의 글

본 연구는 K-water 내부 과제로서 지원금을 받아 수행되었습니다. (과제 번호: G230307)

Fig. 1.

Oxidative cleavage of a microcystin (MC) to form 2-methyl-3-methoxy-4-phenylbuyric acid (MMPB) using KMnO4 and NaIO4 [7].

Fig. 2.

MMPB concentration measured according to sample pretreatment.

Fig. 3.

MMPB concentration after solid-phase extraction (SPE) and liquid-liquid extraction (LLE)

Fig. 4.

Fate of the 4-PB peak in each spike step (a: before freeze-drying, b: before oxidation, c: before LC-MS/MS analysis)

Fig. 5.

Schematic diagram of the MMPB analytical process.

Fig. 6.

MMPB calibration using six MC mixtures.

Table 1.

Current research about MMPB extraction

Reference	Sample	K2CO3	KMnO4	NaIO4	H2SO4	Time	Temp
Kaya, 1999 (6)	SPE	1 M 0.4 mL	0.024 M 0.4 mL	-	10 M 0.2 mL	4hr	Room temp.
Wu, 2009 (9)	Freeze drying	1 M	63.29 M	93.51 mM	10 M	1-4hr	35°C
Wu, 2008 (10)	-	0.02 M	6.33 Mm	93.51 mM	10 M	3hr	Room temp
Wang, 2015 (11)	filtering	5 mg	4000 mg/mL	20 mg/mL	40%	1hr	-
Rosenblum, 2017 (7)	-	1 M 0.2 mL	0.02 M 0.4 mL	0.23 M 0.2 mL	10% 0.4mL	2hr	-
Duncan, 2018 (12)	Freeze drying	0.5 M 1 mL	0.025 M 80 mg	40 mg	6M, few drops	1.5hr	Room temp.
Foss, 2015 (13)	Freeze drying or sonication	-	15 mM	15 mM	-	0.5hr	Room temp.
Foss, 2018 (14)	Sonication	1 M 1 mL	0.25 M 2 mL	0.25 M 2 mL	-		Room temp.

Table 2.

Triple Quad LC-MS/MS conditions for the MMPB analysis

Parameter	Conditions or value
Injection volume (uL)	5
Flow rate (mL/min)	0.4
Mobile phase	A: 0.05% FA in water, B: Methanol
Run time (min)	10
Column	InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (2.1 × 50 mm, 4-Micron, Agilent)
Column temperature (℃)	40
Polarity	Negative
Cylindroospermopsin (Q₁ → Q₃)	(MMPB) 207.0 → 131.0 (4-PB) 163.0 → 91.0
CE	(MMPB) -16.00, (4-PB) -20.00
CXP	(MMPB) -7.00, (4-PB) -4.00
DP	(MMPB) -60.00, (4-PB) -35.00
Gas temperature (℃)	400
IonSpray Voltage (V)	-4500
Nebulizer (microA)	-2.869
Curtain Gas (CUR)	35.0
Collsion Gas (CAD)	Medium
Ion Source Gas 1	50.0
Ion Source Gas 2	55.0

참고문헌

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