구리 표준용액은 황산구리 오수화물(CuSO₄·5H₂O, 대정화금, 한국)을 이용하여 구리 농도가 1000 mg/L이 되도록 100 mL로 제조 한 후 분석하고자 하는 농도가 되도록 희석하여 사용하였으며 진콘용액(Zincon monosodium salt, Alfa Aesar, 미국)은 0.02 M 수산화나트륨(Merck, 미국)를 용매로 하여 1.40 × 10^-4 M의 농도가 되도록 제조하였다. 발색 반응 시 pH를 맞추기 위해 pH 5 완충용액을 사용하였는데 이 완충 용액은 30% 에탄올 용액(Merck, 미국)에 아세트산 나트륨(CH₃COONa, Alfa Aesar, 미국)이 최종적으로 0.2 M이 되도록 넣어준 후 아세트산(CH₃COOH, 삼전화학, 한국)을 이용해 pH 5로 맞춰주었다. 탁도 유발 물질로 사용된 우유(시판용 white whole milk)는 초순수를 이용해 100배 묽힌 후 필요한 탁도 비율에 따라 초순수를 사용하여 묽힌 후 사용하였다. 진콘 시약과 금속 이온의 반응 조건은 금속 용액 2 mL, 우유 0.8 mL, 완충용액 1 mL, 진콘 1 mL 순으로 바이알에 넣은 후 혼합하여 자외선/가시선 분광광도계(UV-1800, SHIMADZU, 일본)와 표준 1 cm 석영 큐벳(10 mm standard, HELLMA, 독일)을 이용해 흡수 스펙트럼을 얻은 후 해당 파장에서의 흡광도 값을 수치 해석에 이용하였다.

시료 중 전처리 과정에서 완벽하게 제거되지 못했거나 pH 조절 등을 통한 2차 탁도가 발생할 수 있다. 예를 들어 진콘은 낮은 pH 환경에서는 용해도가 감소하여 일부 석출될 수도 있다[4]. 탁도는 흡광도에 영향을 주므로 측정의 정확도와 정밀도를 높이기 위해서는 보정이 필요하다. 특정 파장에서 어떤 시료의 총흡광도(A_total)는 개별 흡광도의 선형 합이다. 만약 시료 내에 어떤 파장의 빛을 흡수하는 두 가지 화학종이 있다면 해당파장에서 측정의 그 시료의 총흡광도(A_total) 첫 번째 화학종의 흡광도(A_화학종1)와 두 번째 화학종의 흡광도(A_화학종2)의 선형 합이다[10].

탁도계는 주로 입사광과 검출기의 각도가 90^o±30^o를 초과하지 않는다[11]. 즉, 주로 90^o 각도에서 미세입자에 산란된 빛의 양을 탁도(단위 NTU)로 환산하여 나타낸다. 만약 검출기를 입사광과 일직선상에 마주보게 위치시키면 미세입자가 없을 때보다 있을 때 입사광의 세기는 감소하고 미세입자가 많을 때 즉 시료가 탁해 질수록 그 감소정도는 증가할 것이다. 이 현상은 마치 특정 파장에서 빛을 흡수하는 화학종의 농도가 증가할수록 측정되는 빛의 세기가 지수적으로 감소하고 흡광도는 선형적으로 증가하는 Beer’s의 법칙과 유사하다. 결론적으로 시료의 탁한 정도를 흡광도 단위(AU)로도 측정이 가능하다. 만약 λ₁에서 Beer의 법칙을 만족하는 금속-진콘 착물이 포함된 탁한 용액의 흡광도를 측정한다면, λ₁에서 이 시료의 흡광도(A_λ1)는 금속-진콘 착물의 흡광도(A_착물,λ1)와 미세부유물질의 산란에 의해 유발된 즉, 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ1)의 선형 합으로 얻어지게 된다. 만약 같은 시료를 금속-진콘 착물이 흡수하지 않는 λ₂에서 흡광도를 측정한다면, λ₂ 파장에서의 착물에 의한 흡광도 (A_착물,λ2)는 0이므로 이 시료의 흡광도(Aλ₂)는 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ2)와 같다. λ₂에서 측정한 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ2)와 λ₁에서 측정한 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ1) 사이의 관계식을 알아내면 λ₁에서 측정한 시료의 흡광도(A_λ1)에서 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ1)를 보정한 흡광도 (A_보정)를 얻을 수 있다. 만약 환산인자, F를 흡광도(A_탁도,λ1)를 흡광도(A_탁도,λ2)로 나누어 준 값으로 정의한다면 금속-진콘 착물만의 흡광도(A_착물,λ1)는 λ₂에서 측정한 흡광도(A_탁도,λ2)에 환산인자 F를 곱한 수치를 A_λ1에서 빼줌으로서 얻을 수 있다. 즉, A_보정 값은 {A_λ1 - F × A_탁도,λ2}로 얻어지며 이는 곧 A_착물,λ1과 동일한 값으로 탁도가 보정된 보다 정확한 금속-착물만의 흡광도 값이 된다.

아래 Fig. 1은 진콘 시약, 구리-진콘 착물과 500배로 묽힌 우유 용액의 흡수 스펙트럼을 보여주고 있다. 진콘 시약의 흡수스펙트럼은 468 nm에서 최대를 나타내고 금속-진콘 착물의 흡수 스펙트럼과는 붉은색 파장 영역에서 일부 겹친다. 진콘 시약의 흡수 스펙트럼과는 최대한 많이 겹치지 않으면서 구리-진콘 착물 (λ_max,구리 = 601.5 nm)의 흡수 스펙트럼의 최대 흡수 파장과는 가급적 일치하는 파장을 선택해야 구리의 정량에 유리하다. 따라서, λ_max,구리에 가까운 630 nm를 금속-진콘 착물의 흡광도 측정하기 위한 파장(λ₁)으로 선택하였다. 탁도에 의해 유발되는 흡광도의 측정을 위해서는 분석 대상 물질(금속-진콘 착물)은 물론 바탕용액에 의한 흡수가 일어나지 않는 파장을 선택하여야 한다. 금속과 결합하는 대부분의 유기 리간드는 자외선 영역에서 흡수가 일어나고 색깔을 띤 금속-착물들은 대부분의 가시선 영역대의 빛을 흡수한다. 따라서, 탁도 측정용 파장은 대략 800 nm 이후의 파장 중 하나를 선택하는 것이 좋다. 본 연구에서는 880 nm를 탁도를 보정하기 위한 파장(λ₂)으로 선택하였는데, 그 이유는 추후 880 nm 발광다이오드를 광원으로 하는 탁도 보정 기능을 가진 흡광도 측정기기를 개발하는데 활용하기 위함이다.

λ₂(880 nm)에서 측정한 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ2)를 λ₁(630 nm)에서 측정한 탁도에 의한 흡광도(A_탁도,λ1)로 환산하여 주기위해 먼저 두 파장에서 탁도 변화에 따른 흡광도 변화 곡선, 즉, 탁도 검정곡선을 구하여야 한다 (Figure 2). 상대적인 탁도를 유발하기 위해 시중에서 구입한 흰 우유를 1/1000, 1/500, 1/100로 묽힌 용액을 사용하였다. 두 파장 모두 원점을 지나는 상관계수가 매우 높은 검정곡선이 얻어졌다. 환산인자 F는 두 검정곡선의 기울기의 비(ratio)로 결정할 수 있다. 즉, F = m_λ1/m_λ2 = 101.3/48.4 = 2.09.

탁도는 입자의 크기, 모양 및 색상에 따라 그 값이 크게 변한다. 따라서 흰 우유 용액의 매트릭스를 변화시켜 그 형상에 변화를 주었을 때 F 값이 어떻게 변하는지 확인하여 보았다 (Table 1). 두 파장에서의 절대 흡광도 값은 흰 우유의 pH 조건이나 매트릭스가 변함에 따라 해당 파장에서의 절대 흡광도 값은 변화가 %RSD가 33~39%로 매우 크게 변하는 반면 F 값은 7.1% RSD로 상대적으로 안정적임을 알 수 있다. 이를 통해 흡광광도법에서 두 파장을 이용한 탁도 보정 기법이 매우 유용함을 확인할 수 있다. 본 연구에서는 흰 우유를 단순 탁도 유발 물질로 활용하였다. 실제 시료 용액에서 탁도 유발 물질의 성질은 우유와는 매우 달라질 수도 있다. 이때 실제 시료에 포함된 탁도 유발 물질을 이용하여 (즉, 원 시료 용액을 이용하여) 위와 유사한 사전 실험을 통해 실제시료에 맞는 F값을 구하여 탁도 보정에 사용하는 것이 필요하다.

630 nm을 λ₁으로 880 nm를 λ₂로 결정하여 실험을ﾠ진행하였으므로 630 nm에서 시료용액(흰 우유 입자에 의해 유발된 용액 속의 구리-진콘 착물 용액)의 흡광도, A₆₃₀를 보정하기 위해서는 {A_보정 = A₆₃₀ − F · A_탁도,880} 식을 사용하여야 한다. Table 2는 이 식을 사용하여 탁도를 보정하기 전과 후 오차율을 표시한 표이다. 탁도를 보정하기 전의 오차율은 62.4~488%이였으나 보정 후 오차율은 최대 20.3%를 넘지 않아 효과적으로 탁도를 보정할 수 있음을 확인하였다. 흡광도는 탁도가 높을수록 구리이온의 농도가 낮을수록 탁도의 영향을 더 크게 받음을 확인할 수 있다. 이는 시료 전처리 과정을 통해 원시료의 미세부유물질을 모두 제거하고 흡광도를 측정해야하며, 어떤 연유에서나 탁도가 미세하게 남아있는 경우 이러한 보정 기술을 사용하여 흡광도 측정에서의 정확도를 높일 필요가 있음을 암시한다. 제시된 탁도 보정 기술이 약 500 μg/L 이상의 농도에서는 안정적으로 활용이 가능할 것으로 확인되었다. 그러나 탁도가 매우 높은 시료의 경우에는 화합물의 농도가 높다 하여도 원 시료의 흡광도 수치(raw data)의 정밀도가 매우 낮아지므로 본 보정 기술을 적용하기에는 매우 제한적일 것으로 보인다.